가스크로마토그래프법은 적당한 고정상을 써서 만든 칼럼에 검체혼합물을 주입하고 이동상으로 불활성기체(캐리어가스)를 써서 고정상에 대한 유지력의 차를 이용하여 각각의 성분으로 분리하여 분석하는 방법으로, 기체 검체 또는 기화할 수 있는 검체에 적용할 수 있으며 물질의 확인, 순도시험 또는 정량등에 쓴다. 칼럼에 주입된 혼합물은 각 성분의 고유의 비율 k로 이동상과 고정상으로 분포한다.
k = 고정상에 존재하는 양/이동상에 존재하는 양
이 비율 k와 이동상의 칼럼통과시간 t0(k = 0인 물질의 검액주입시부터 피크정점까지의 시간) 및 유지시간 tR(측정검액의 주입시부터 피크정점까지의 시간)과의 사이에는 다음과 같은 관계가 있으며 같은 조건에서는 유지시간은 물질의 고유한 값이 된다.
tR = (1+k)t0
장 치 보통 캐리어가스 도입부 및 유량제어장치, 검체도입부, 칼럼, 칼럼항온조, 검출기 및 기록장치로 되어있고 필요하면 연소가스, 조연(助燃)가스 및 부가(付加)가스등의 도입장치 및 유량제어장치, 헤드스페이스용 검체도입장치등을 쓴다. 캐리어가스 도입부 및 유량제어장치는 캐리어가스를 일정한 유량으로 칼럼속으로 보내는 것으로 보통 압력조절밸브, 유량조절밸브 및 압력계등으로 구성된다. 검체도입장치는 일정량의 검체를 정확하고 재현성이 좋게 캐리어가스 유로중에 도입하기 위한 장치로 충전칼럼용과 모세관칼럼용이 있다. 또한 모세관칼럼용 검체도입장치에는 분할도입방식과 비분할도입방식의 장치가 있다. 보통 칼럼은 충전칼럼 및 모세관칼럼의 두 종류로 분류된다. 충전칼럼은 일정한 크기를 갖춘 가스크로마토그래프용 충전제를 불활성인 금속, 유리 또는 합성수지관에 균일하게 충전한 것이다. 충전칼럼 안지름이 1 mm 이하의 것은 충전모세관칼럼(마이크로팩트칼럼)이라고 한다. 모세관칼럼은 불활성금속, 유리, 석영 또는 합성수지의 관 내면에 가스크로마토그래프용 고정상을 유지시킨 중공구조인 것이다. 칼럼항온조는 필요한 길이의 칼럼을 수용할 수 있을 정도로 크고 칼럼온도를 일정하게 유지하기 위한 온도제어장치를 가지고 있다. 검출기는 칼럼으로 분리된 성분을 검출하는 것으로 알칼리열이온화검출기, 염광광도검출기, 질량분석계, 수소염이온화검출기, 전자포획검출기, 열전도도검출기 등이 있다. 기록장치는 검출기에서 얻어진 신호의 강도를 기록하는 것이다.
조 작 법 따로 규정이 없는 한 다음 방법에 따른다. 장치를 미리 조정한 다음 원료 각조에 규정하는 조작조건의 검출기, 칼럼 및 캐리어가스를 쓰고, 캐리어가스를 일정한 유량으로 흐르게 하고 칼럼을 규정의 온도에서 평형으로 한 다음, 원료 각조에서 규정하는 양의 검액 또는 표준액을 마이크로시린지를 써서 검체도입부를 통하여 주입한다. 분리된 성분은 검출기로 검출하고 기록장치에서 크로마토그램으로 기록한다.
확인 및 순도시험 확인은 검액과 표준액의 유지시간의 일치 또는 검액에 표준액을 첨가하여도 유지시간이 변하지 않고 피크폭이 넓어지지 않는지의 여부로 시험한다. 순도는 보통 검액 중의 혼재물의 한도에 해당하는 농도의 표준액을 쓰는 방법 또는 면적백분율법으로 시험한다. 따로 규정이 없는 한 검액의 이성체비는 면적백분율법에 의하여 구한다.
면적백분율법은 크로마토그램상에서 얻어진 각 성분의 피크면적의 총계를 100으로 하고 이에 대한 각 성분의 피크면적비로부터 조성비를 구한다. 다만, 정확한 조성비를 얻기 위해서는 혼재물의 검출감도에 따라 피크면적을 보정한다.
정 량 보통 내부표준법에 따르지만 적당한 내부표준물질을 얻을 수 없을 때에는 절대검량선법으로 시험한다. 정량결과에 대하여 피검성분 이외의 성분의 영향이 무시될 수 없을 때는 표준첨가법에 따른다.
1) 내부표준법 내부표준법에서는 일반적으로 되도록 피검성분에 가까운 유지시간을 가지며 모든 피크와 완전히 분리되는 안정한 물질을 내부표준물질로 선택한다. 원료 각조에 규정하는 내부표준물질 일정량에 대하여 피검표준품을 단계적으로 넣어 여러종류의 표준액을 조제한다. 이들 표준액 일정량씩을 주입하여 얻은 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피크면적 또는 피크높이에 대한 피검표준품의 피크면적 또는 피크높이의 비를 구한다. 이 비를 종축으로 하고 표준피검성분량 또는 내부표준물질량에 대한 표준피검성분량의 비를 횡축으로 하여 검량선을 작성한다. 이 검량선은 보통 원점을 지나는 직선이 된다, 다음에 원료 각조에 규정하는 방법으로 같은 양의 내부표준물질을 넣은 검액을 조제하고 검량선을 작성하였을 때와 같은 조건으로 크로마토그램을 기록하여 그 내부표준물질의 피크면적 또는 피크높이에 대한 피검성분의 피크면적 또는 피크높이비를 구하고 검량선을 써서 피검성분량을 구한다.
원료 각조에서는 보통 상기의 검량선이 직선이 되는 농도범위에 들어가는 하나의 표준액 및 표준액에 가까운 농도의 검액을 조제하여 원료 각조에서 규정하는 각각의 양에 대하여 같은 조건으로 가스크로마토그래프법에 따라 시험하여 피검성분량을 구한다. 보통 표준액의 규정량을 반복 주입하여 얻어진 각각의 크로마토그램에서 내부표준물질의 피크면적 또는 높이에 대한 표준피검성분의 피크면적 및 높이의 비를 구하고 그 상대표준편차(변동계수)를 구하여 재현성을 확인한다.
2) 절대검량선법 피검표준품을 단계적으로 취하여 표준액을 조제하고 표준액 일정량씩을 정확하고 재현성있게 주입한다. 얻어진 크로마토그램으로부터 종축에 표준피검성분의 피크높이 또는 피크면적, 횡축에 표준피검성분량을 취하여 검량선을 작성한다. 이 검량선은 보통 원점을 지나는 직선이 된다. 다음에 원료 각조에 규정하는 방법으로 검액을 조제하여 검량선을 작성하였을 때와 같은 조건으로 크로마토그램을 기록하여 피검성분의 피크높이 또는 피크면적을 측정하고 검량선을 써서 피검성분량을 구한다.
원료 각조에서는 보통 상기의 검량선이 직선이 되는 농도범위에 들어가는 하나의 표준액 및 표준액에 가까운 농도의 검액을 조제하고 원료 각조에서 규정하는 각각의 양에 대하여 같은 조건으로 가스크로마토그래프법에 따라 시험하여 피검성분량을 구한다. 이 방법은 모든 측정조작을 엄밀하게 일정한 조건으로 하여 시험한다. 보통 미리 표준액의 규정량을 반복 주입하여 얻은 각각의 크로마토그램의 피크면적 또는 높이를 측정하고 그 상대표준편차(변동계수)를 구하여 재현성을 확인한다.
3) 표준첨가법 검액에서 4 개 이상의 일정액을 정확하게 취한다. 이 중 1 개를 제외하고 채취한 액에 피검성분의 표준액을 피검성분의 농도가 단계적으로 다르게 되도록 정확히 넣는다. 이 액 및 먼저 제외한 1 개의 액을 각각 정확하게 일정량으로 희석하여 각각 검액으로 한다. 이 액의 일정량씩을 정확히 재현성있게 주입하여 얻어진 크로마토그램에서 각각의 피크면적을 구한다. 각각의 검액에 넣은 피검성분의 농도를 산출하여 횡축에 표준액 첨가에 의한 피검성분의 증가량을, 종축에 면적을 취하고 그래프에 각각의 값을 표시하여 관계선을 작성한다.
관계선의 횡축과의 교점과 원점과의 거리에서 피검성분량을 구한다. 보통 표준액의 규정량을 반복 주입하여 얻어진 각각의 크로마토그램으로부터 표준피검성분의 피크면적을 구하고 그 상대표준편차(변동계수)를 구하여 재현성을 확인한다. 또한 이 방법은 절대검량선법으로 피검성분의 검량선을 작성하였을 때 검량선이 원점을 지나는 직선일 때 적용할 수 있다. 또 모든 측정조작을 엄밀하게 일정한 조건을 유지하여 시험한다.
피크측정법 보통 다음의 방법을 쓴다.
1) 피크높이측정법 가) 피크높이법 피크의 정점에서 기록지의 횡축으로 내린 수선(垂線)과 피크의 양끝을 연결하는 접선(기선)과의 교차점으로부터 정점까지의 길이를 측정한다.
나) 자동피크높이법 검출기로부터의 신호를 데이터처리장치를 써서 피크높이로 측정한다.
2) 피크면적측정법 가)반치폭법 피크높이의 중심점에서의 피크폭에 피크높이를 곱한다. 나) 자동적분법 검출기로부터의 신호를 데이터처리장치를 써서 피크면적을 측정한다.
용 어 검출감도 순도시험에서 분석목적물질을 확실하게 검출하기 위하여 표준액 등의 일정량을 주입하고 그 검출의 정도를 구하여 조작이 시험목적에 적합한지의 여부를 검증하기 위한 것이다. 데이터처리장치를 쓸 때에는 보통 피크면적(μV?s)으로, 기록계를 쓸 때는 보통 피크높이(mm)로 규정한다. 또한 검출한계 또는 정량한계를 써서 규정할 수 있다.
시험의 재현성 시험조작은 원료 각조의 설정시와는 다른 상황하에서 이루어진다. 따라서 시험의 재현성은 얻어지는 결과가 초기 시험방법의 목적에 적합한지의 여부를 검증하는 한가지 방법으로 사용된다. 시험의 재현성은 상대표준편차 SR(%)로 규정한다.
대칭계수 크로마토그램상의 피크의 대칭성의 정도를 나타내는 것으로 대칭계수 S 로서 다음식으로 정의된다.
W0.05h : 피크의 기선에서 피크높이의 1/20의 높이에서의 피크폭
f : W0.05h의 피크폭을 피크의 정점에서 기록지의 횡축에 내린 수선으로 2 등분 했을 때의 피크의 올라가는 쪽의 거리. 다만, W0.05h, f 는 같은 단위를 사용한다.
상대표준편차 : 보통 다음식으로 정의되는 상대표준편차 SR(%)로 규정된다.
xi : 측정치
X : 측정치의 평균값
n : 측정회수
피크의 완전분리 피크가 완전분리한다는 것은 분리도 1.5 이상을 의미한다.
분리계수 크로마토그래프상의 피크상호의 유지시간의 관계를 나타내는 것으로 분리계수 α라 하며 다음식으로 정의된다. 분리계수α는 두 개의 물질의 분배의 열역학적차이의 지표로서, 기본적으로는 두 개의 물질의 분배 평형계수의 비 또는 두 개의 물질의 질량분포비의 비이지만, 크로마토그램에서 두 개의 물질의 유지시간의 비로서 구한다.
α =
tR1, tR2 : 분리도측정에 사용하는 2개의 물질의 유지시간. 다만, tR1 ＜ tR2
t0 : 이동상의 칼럼 통과시간 (k = 0의 물질의 검체 주입시에서 피크정점까지의 시간)
분리도 크로마토그램상의 피크 상호의 유지시간과 각각의 피크폭과의 관계를 나타내는 것으로 분리도 Rs로서 다음식으로 정의된다.
tR1, tR2 : 분리도 측정에서 사용하는 두 개의 물질의 유지시간. 다만, tR1 ＜ tR2
W0.5h1, W0.5h2 : 각각의 피크의 높이의 중점에서의 피크폭
단, tR1, tR2, W0.5h1, W0.5h2 는 같은 단위를 사용한다.
이론단수 칼럼중에서 물질의 밴드의 넓어지는 정도를 나타내는 것으로서 보통 다음식으로 정의된다.
tR : 물질의 유지시간
W0.5h : 피크높이의 중심점에서 피크폭. 다만, tR, W0.5h는 같은 단위를 사용한다.
주의 : 표준피검품, 내부표준물질, 시험에 쓰는 시약?시액은 측정을 방해하는 물질을 함유하지 않는 것을 쓴다. 원료 각조의 조작 조건 중에서 칼럼의 안지름 및 길이, 충전제의 입자경, 고정상의 농도, 칼럼온도, 캐리어가스의 유량은 규정된 유출순서, 분리도, 대칭계수 및 상대표준편차를 얻을 수 있는 범위내에서 일부 변경할 수 있다. 다만, 헤드스페이스용 검체주입장치 및 그 조작조건은 규정하는 방법 이상의 정확도, 정밀도가 인정되는 범위내에서 변경할 수 있다.
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